RESUMEN: La tuberculosis es actualmente un problema de salud mundial, su alta incidencia es debida, en gran parte, a la aparición de cepas multi y extensivamente resistentes (MDR y XDR). Este problema se complica aún más, ya que las técnicas convencionales para la determinación de la susceptibilidad a drogas de Mycobacterium tuberculosis requieren tiempos muy prolongados para obtener resultados. Los sistemas comerciales y los métodos moleculares requieren equipos y medios que no son accesibles a los laboratorios de países de escasos recursos, en la mayoría de los cuales, la farmacorresistencia representa un serio problema de salud clínico y público. El objetivo de este trabajo fue el de estandarizar y optimizar dos métodos colorimétricos y uno citofluorométrico, teniendo como referencia a los métodos de las proporciones en agar (MPA) y el método radiométrico BACTEC. Se utilizaron un total de 5 cepas de micobacterias atípicas para la estandarización de las técnicas; así como 3 cepas de referencia y 60 aislados clínicos de M. tuberculosis para la evaluación de las metodologías frente a estreptomicina (SM), isoniacida (INH), rifampicina (RIF) y etambutol (EMB). Mediante el análisis de las curvas ROC (Receiver-Operating Characteristic- curves) se determinó, entre otros parámetros el punto de corte para cada fármaco, el área bajo la curva y el valor de significancia estadística (p). Además, mediante tablas de contingencia 2 X 2 se determinó el desempeño y los valores predictivos de las metodologías. Los resultados se obtuvieron en un promedio de 13 días para el método del Alamar Azul y de 12 días para el de MTT. Los puntos de corte obtenidos para cada fármaco mediante el micrométodo MABA fueron de 2 μg/ml para SM, 0.25 μg/ml para INH, 0.25 μg/ml para RIF y 8 μg/ml para EMB; y para el micrométodo MTT fueron de 2 μg/ml para SM, 0.25 μg/ml para INH, 0.125 μg/ml para RIF y 4 μg/ml para EMB. Los valores de p para ambos micrométodos fueron altamente significativos (p0.951 para INH, RIF y ETM; mientras que para SM fue de 0.884. La comparación MABA vs BACTEC presentó valores de área bajo la curva de >0.903 para INH y RIF, mientras que para SM y EMB fueron >0.793. En el caso de MTT comparado con los métodos de referencia fueron > 0.904, excepto para la determinación de EMB y SM en la comparación MTT vs BACTEC (0.852 y 0.898 respectivamente). Los resultados demostraron que los ensayos de Alamar Azul y MTT son rápidos, baratos, fáciles de realizar y sobretodo, son métodos confiables para la determinación de farmacosensibilidad de micobacterias. En comparación, la determinación de sensibilidad por citometría de flujo presentó una alta inconsistencia en los resultados y una falta de correlación con el método de referencia (MPA), por lo que consideramos que esta metodología no es idónea para la determinación rutinaria de sensibilidad micobacteriana a fármacos, además de que es una técnica costosa que utiliza un equipo especializado.
ABSTRACT: Nowadays, tuberculosis is a worldwide health problem. Its high incidence is due to the emergency of multi and extensively drug resistant mycobacteria (MDR, XDR). Conventional techniques to determine drug sensitivity in Mycobacterium tuberculosis, are time consuming. Commercially available methods including molecular methods require special equipments that are not accessible for laboratories in poor settings. The aim of this study was to standardize and to optimize two colorimetric methods and one cytofluorometric method, using the proportion method (MPA) and the radiometric BACTEC method as gold standard methods. Five non-tuberculous mycobacteria species, 3 M. tuberculosis reference strains, and 60 M. tuberculosis clinical isolates were used in the standardization to the drugs streptomycin (SM), isoniazid (INH), rifampicin (RIF) and ethambutol (EMB). ROC curves analysis (Receiver-Operating Characteristic) allowed determination of cut-off value; area under the curve (AUC) and the p value for each drug. Performance of colorimetric methods was determined by 2x2 contingency table analysis. Drug susceptibility determination was completed in an average of 13 days of incubation for the Alamar Blue microcolorimetric assay (MABA) and by 12 days for the MTT method. Cut-off point by MABA were 2 μg/ml for SM, 0.25 μg/ml for INH, 0.25 μg/ml for RIF and 8 μg/ml for EMB; and for MTT were 2 μg/ml for SM, 0.25 μg/ml for INH, 0.125 μg/ml for RIF and 4 μg/ml for EMB. Statistically significant p values for both colorimetric methods were high (p0.951 for INH, RIF and ETM; while for SM was of 0.884; AUC for MABA vs BACTEC comparison were lower: >0.903 for INH and RIF determination and for SM and EMB determination were >0.793. In the case of MTT method, using MPA or BACTEC as gold standards, AUC values were > 0.904, except for EMB and SM were BACTEC was the gold standard (0.852 and 0.898 respectively). The results indicated that microcolorimetric assays are quick, cost-efficient and easy to perform determination, but most importantly they are reliable methods for mycobacterial drug-susceptibility determination. Contrary, after extensive experimentation, cytofluorometric staining method, gave irreproducible results, and a lack of correlation with the gold standard determination (MPA), which leads us to discarding the before mentioned assay. Besides this is an expensive technique, that requires a special equipment and a special sample treatment for avoiding biological risk due to aerosol generation.
