RESUMEN: Mycobacterium avium es una micobacteria ubicua y saprofítica encontrada generalmente en el suelo y en el agua. La virulencia y los factores de patogenicidad de esta micobacteria aún no se han estudiado ampliamente, aunque se sabe que en la infección adquirida por vía respiratoria existe la formación de lesiones granulomatosas indistinguibles de las producidas por M. tuberculosis, por lo que se sugiere que la patogenia pudiera ser similar. La latencia, es el estado potencial para el desarrollo de enfermedad por M. tuberculosis; algunos de los factores que han sido considerados para el inicio de la latencia, son la hipoxia y la falta de nutrientes. Hasta el momento, no se conoce la respuesta fisiológica de M. avium hacia las condiciones de hipoxia. Por lo tanto, en este trabajo el objetivo fue determinar el efecto de la hipoxia y la falta de nutrientes sobre la morfología celular y la expresión de genes involucrados en el metabolismo de lípidos y otros componentes de la envoltura celular de M. avium. La cepa de M. avium se cultivó hasta fase logarítmica de crecimiento y se expuso a diferentes tiempos en condiciones de hipoxia y falta de nutrientes. Se aisló el RNA total y se cuantificó la expresión de once genes relacionados con la latencia, con el metabolismo de lípidos y con la regulación celular de M. avium (hsp, aceA, fadD32, accD4_1, glpK, pgsA, lipU, embA, mmpL4_2, narG y sigD) mediante RT-PCR en tiempo real. Así mismo, se determinaron los cambios morfológicos de esta micobacteria bajo las diferentes condiciones mediante microscopía electrónica de barrido y de transmisión. Se encontró que durante la hipoxia temprana (26 días) sucedió una gran expresión de genes involucrados en la síntesis de lípidos micobacterianos (de 60 a 780 veces más que en fase log); además, también se requirió la síntesis de arabinogalactana para que M. avium se adaptara a dicha condición. Por otro lado, la exposición de M. avium a la falta de nutrientes provocó la disminución de la expresión de la mayoría de los genes involucrados en el metabolismo de lípidos (hasta 3.6x104 veces con respecto a la fase logarítmica), con excepción de lipU (sobreexpresión de 2 veces). En cuanto a la morfología celular, la hipoxia produjo en las células de M. avium una disminución en el tamaño y un aumento de pleomorfismo y rugosidad. Así mismo, se observó la aparición de cuerpos de inclusión tipo vacuolas en el interior de las células, las cuales posiblemente sean depósitos de lípidos. Por otro lado, las células de M. avium que fueron sometidas a la falta de nutrientes experimentaron una disminución en el tamaño de una forma más rápida que durante la hipoxia. Además se observó una gran cantidad de restos celulares a los 60 días de exposición en esta condición. Finalmente, los resultados encontrados demuestran que M. avium puede regular los niveles de expresión genética y su viabilidad a la falta de oxígeno más fácilmente que a la falta de nutrientes. Pareciera que durante esta última condición, las micobacterias disminuyen de forma general la expresión de los genes involucrados en varios ciclos metabólicos y por lo tanto, también disminuye su viabilidad.
ABSTRACT: Mycobacterium avium is a saprofitic and worldwide distributed mycobacterium, generally isolated from water and soil. Although it is known that in M. avium the production of granulomatous lesions is very similar to the one produced by M. tuberculosis during the respiratory infection, virulence factors involved in M. avium pathogenicity have not been widthly studied yet. In M. tuberculosis the potential stage for the development of disease is the dormancy state; hypoxic conditions and starvation are the main factors that start dormancy in mycobacteria. Until now, the physiological response of M. avium to hypoxic conditions has not been studied yet. Therefore, the aim of this work was to determine the effect of hypoxia and starvation conditions on the cellular morphology and the expression of some genes involved in lipid metabolism and cell envelope components of M. avium. A logarithmic phase culture of M. avium was exposed to hypoxia and starvation conditions at different times, according to Wayne and Archuleta dormancy models, respectively; total RNA was isolated and the expression of eleven genes involved in dormancy, lipid metabolism and cellular regulation (hsp, aceA, fadD32, accD4_1, glpK, pgsA, lipU, embA, mmpL4_2, narG y sigD) of M. avium was quantified by real time RT-PCR. At the same time, morphological changes of the mycobacterial cell under those conditions were determined by electron microscopy (transmission and scanning). In this study, a high expression of genes involved in mycobacterial lipid synthesis (from 60 to 780 times more than in log phase) was found during early hypoxia (26 days); furthermore, in order that M. avium could be adapted to this stress condition, arabinogalactan synthesis was also required. On the other hand, during starvation conditions, expression of most M. avium genes involved in lipid metabolism was diminished (till 3.6x104 times compared to log phase); lipU was the only overexpressed gene under this condition (2 times compared with log phase). Regarding cellular morphology, hypoxic conditions led to a population of smaller M. avium cells (compared to log phase) and an increasing of pleomorphic and rough cells into the culture. Several cytoplasmic vacuola-like inclusions, possibly as cell lipids storage, were also observed during these conditions. In respect to starvation conditions, M. avium cells decreased their size in a quicker fashion compared to hypoxia. Besides, a big amount of cellular debris was observed at day 60 of starvation exposure. Finally, our results have shown that under hypoxia M. avium can regulate gene expression and viability in a better way than cells in starvation conditions. It seems that under this latter condition mycobacteria decrease the expression of genes involved in several metabolic cycles and therefore, they also loss viability.
