RESUMEN: La familia de las ENTPDasas juega un papel importante en la regulación de una variedad de estados fisiológicos, mediante la modulación de los niveles de nucleótidos en el microambiente celular y su co-localización con receptores P2. A pesar de los grandes avances logrados en los últimos años el papel fisiológico de estas enzimas no ha sido elucidado completamente.
En el presente trabajo se obtuvieron ocho vectores de expresión conteniendo los genes que codifican para las enzimas ENTPDasa1 y 2 nativas y los receptores purinérgicos P2Y1 y P2Y2 con diferentes etiquetas (Myc y Hexahistidina) y proteínas reporteras fluorescentes. El vector de expresión conteniendo los genes para la fusión ENTPDasa2-Proteína verde fluorescente fue expresado en células Jurkat, encontrando que la fusión es expresada en la membrana de las células en comparación con la proteína control (fluorescente verde), que es expresada en citoplasma celular.
Vectores de expresión conteniendo genes que codifican para las enzimas ENTPDasa1 ó ENTPDasa2 fusionadas con el receptor P2Y1 fueron obtenidos. La fusión ENTPDasa1-P2Y1 se expresó en células CHO-KI y se comparó la actividad de ATPasa y ADPasa con aquella desarrollada por la enzima nativa, encontrando actividad semejante y una relación molecular de hidrólisis de ATPasa/ADPasa de 1:0.4.
Paralelamente se buscó un modelo bacteriano con altos niveles de expresión (E.coli) para los vectores conteniendo genes que codifican para las enzimas ENTPDasa1, 2 y 3 soluble (sin dominios transmembranales). Encontrando que ninguna de las tres enzimas tuvo los niveles de expresión esperados, además de que éstas fueron inactivas, probablemente debido a que no están glicosiladas. En células de mamíferos CHO-K1 el nivel de expresión fue adecuado por lo que se utilizó para purificar y caracterizar la enzima ENTPDasa3 soluble. Esta fue purificada 96 veces con una actividad específica de 140 μmoles/min/mg de proteína. Los parámetros cinéticos aparentes determinados sobre la actividad ATPasa de la enzima ENTPDasa3 soluble parcialmente purificada, fueron Km=68.30μΜ y Vmax=27.54 μmoles/min/mg proteína y se compararon con los parámetros cinéticos de la enzima ENTPDasa3 nativa (membranas totales) de Km=40.57μM y Vmax=0.919 μmoles/min/mg proteína y con los reportados en otros trabajos para la enzima ENTPDasa3 nativa (Km de 14 a 100μM); donde podemos observar que los parámetros determinados en este trabajo están dentro del rango reportado y son mayores que los reportados para la enzima ENTPDasa1 soluble (10 μM). La actividad hidrolítica, con diferentes nucleótidos, de la enzima ENTPDasa3 soluble muestra una preferencia por los trinucleótidos, lo cual es similar a lo descrito para la ENTPDasa3 nativa en otros estudios.
Las construcciones obtenidas en este trabajo serán de utilidad en el estudio del papel fisiológico de éstas proteínas dado que no interferirán con su función. Además se obtuvo una forma soluble de la enzima ENTPDasa3 cuyas características cinéticas no cambian por lo que puede ser un buen candidato como agente terapéutico en condiciones patofisiológicas en donde ésta enzima se encuentre involucrada, dada la facilidad de manejo de la forma soluble.
ABSTRACT: ENTPDases play an important role in the regulation of several physiological conditions. Nevertheless the advances in the knowledge about the physiological function of these enzymes are unknown. In this work we obtained eight expression vectors with codificant genes for wild type ENTPDase1 and 2 enzymes, purinergic receptors P2Y1 and P2Y2 with different tags (Myc and hexahistidine) and reporter fluorescent proteins. Expression vectors were sequenced to guarantee the expression. Vector containing fusion genes to produce ENTPDase2-protein fluorescent green was expressed in Jurkat cells and results showed that fusion protein was expressed in cells membrane, and protein fluorescent green in citosol.
In addition, expression vectors containing codificant genes to ENTPDase1 or ENTPDase2 fused with P2Y1 were obtained. ENTPDase1-P2Y1 was expressed in CHO-KI cells and ATPase and ADPase activity was compared against the wild type enzyme, finding a molecular hydrolysis ATPase/ADPase ration of 1:0.4.
To find a model with high enzyme expression levels, we used E. coli to express ENTPDase1, 2 and 3 enzymes. These enzymes did not show the expected expression levels and were inactive probably by a glycosilation process. In the other hand, CHO-KI cells showed good expression levels, and this model was used to purify ENTPDase3 soluble enzyme.
Soluble ENTPDase3 was purified 96 times and show a specific activity of 140 μmol/min/mg protein, ATPase kinetic parameters of soluble ENTPDase3 were Km 68.3 μM and Vmax 27.54μM/min/mg protein, the comparison of these kinetic parameters with the wild type ENTPDase3 (Km 40.57 μM and Vmax 0.919 μM/min/mg protein and other reports (Km 14 to 100 μM), shown that the results obtained in this work were inside the expected range and were higher in comparison with soluble ENTPDase 1 (10 μM) reported.
Soluble ENTPDase3 hydrolytic activity using different nucleotides showed preference for trinucleotides and is agree with the results obtained by other works using wild type ENTPDase3.
In conclusion in this work were obtained expression vectors by the fusion of enzymes and receptors with different tags. These systems will be useful to study the physiological role of these proteins. In addition, a soluble form ENTPDase3 was obtained with kinetic characteristic unchanged which can have a putative therapeutic use.
