Análisis de la microbiota en sueros lácticos A1 y A2

Abstract

RESUMEN: Actualmente se tiene mayor interés en las poblaciones bacterianas encontradas en comida, como la leche y el queso. Sin embargo, poca atención se ha prestado a las poblaciones relacionadas al genotipo de la β-caseína presente en la leche y el subproducto de lactosuero derivado del queso. Estas poblaciones toman importancia dentro de la posibilidad de encontrar bacterias capaces de degradar biopéptidos activos derivados de la β-caseína A1, los cuales han sido relacionados con patologías como diabetes mellitus I, enfermedades cardiovasculares, trastornos del espectro autista, entre otros. Los lactobacilos, presentes en una gran variedad de alimentos como el lactosuero, son usados en la industria alimenticia como iniciadores para productos como queso, yogurt, kéfir. Otros de sus principales usos son probióticos, que han sido recomendados como un tratamiento auxiliar en diversas patologías como prevención de la diarrea asociada a antibióticos, tratamiento de la diarrea aguda infecciosa, prevención de infección por Clostridium difficile y enterocolitis necrosante, el alivio de los síntomas del síndrome de intestino irritable, entre otros. En virtud de lo anterior, en este trabajo se propone analizar la microbiota presente en lactosuero derivado de leche A1 y A2, además de obtener aislados bacterianos y determinar su potencial probiótico. A partir de 15 muestras de leche de vacas raza Holstein genotipificadas como A1/A1 (n=4) y A2/A2 (n=3) por discriminación alélica, se seleccionaron para la obtención de lactosuero, de donde se realizó la extracción de ADNm y la amplificación de las regiones hipervariables V3-V4 del gen 16S ARNr para la secuenciación masiva de estas regiones. Los datos obtenidos indicaron que la mayoría de las poblaciones encontradas en las muestras, independientemente de su genotipo, fue la familia Proteobacteria, seguida de las familias Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes. Estos resultados no concuerdan con lo que se ha reportado en leche sin pasteurizar o quesos, en donde se han encontrado en su mayoría bacterias pertenecientes a las familias Firmicutes seguido de Proteobacteria, Actinobacteria y Bacteroidetes. X V Las poblaciones encontradas en este estudio pueden ser resultado de diversos factores como las condiciones de las glándulas mamarias, la piel de la ubre, la máquina de ordeña, calidad del aire y las prácticas de ordeña como fuentes de contaminación, que aun cuando se haya cumplido con requisitos generales de salubridad, la microbiota del ecosistema local tendrá un marcado impacto en las poblaciones bacterianas de la leche cruda. Las muestras de lactosuero fueron así mismo inoculadas en el medio selectivo MRS para la obtención de poblaciones bacterianas como lactobacilos, en donde de los 30 aislados encontrados en conjunto, se identificó por métodos moleculares tres aislados de L. fermentum cepa LS3. Esta bacteria mostró ser capaz de crecer en un rango de pH de 3-8, indicando la posibilidad de sobrevivir a lo largo del tracto gastrointestinal. En el caso de su sobrevivencia en presencia de sales biliares, no se mostró crecimiento. Además, se encontró que L. fermentum cepa LS3 fue resistente a todos los antibióticos: ciprofloxacino, sulfametoxasol con trimetroprim, ampicilina, cefalotina, cefotaxima, dicloxaciclina, penicilina, vancomicina, clindamicina, eritromicina, gentamicina y tetraciclina, mostrando un halo de inhibición de 0-9 mm. Esta resistencia a antibióticos se debe evaluar más a fondo, debido a que la presencia de genes de resistencia adquiridos en microorganismos probióticos representa un peligro para la salud humana, debido a la transferencia de estos genes a otras bacterias presentes en la microbiota gastrointestinal, haciendo los tratamientos farmacológicos menos efectivos contra las bacterias patógenas que adquieran estos genes de resistencia ABSTRACT: Ultimately there is greater interest in bacterial populations found in food, such as milk and cheese. However, little attention has been given to populations related to the genotype of the β-casein present in milk and the by-product of cheese-derived whey. These populations are important in the possibility of finding bacteria capable of degrading active biopeptides derived from β-casein A1, which have been related to pathologies such as diabetes mellitus type I, cardiovascular diseases and autism spectrum disorders, among others. Lactobacilli, present in a wide variety of foods such as whey, are used in food industry as initiators for products such as cheese, yogurt and kefir, among others. However, other of its main uses are probiotics, which have been recommended to function as an auxiliary treatment in various pathologies such as prevention of antibiotic-associated diarrhea, treatment of acute infectious diarrhea, prevention of Clostridium difficile infection and necrotizing enterocolitis, relief of symptoms of irritable bowel syndrome, among others. By virtue of the foregoing, this work proposes to analyze the microbiota present in whey derived from milk A1 and A2, in addition to obtaining bacterial isolates and determining their probiotic potential. Fifteen samples of milk from Holstein cows genotyped as A1/A1 (4) and A2/A2 (3) by allele discrimination by qPCR were selected for obtaining whey, from which mDNA extraction and amplification of V3-V4 hypervariable regions of the 16S rRNA gene for mass sequencing of these regions was performed. Data obtained indicated that the majority of the populations found in the samples, regardless of their genotype, was Proteobacteria family, followed by Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes families. These results do not match what has been reported in unpasteurized milk or cheeses, where mostly bacteria belonging to the Firmicutes families followed by Proteobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes have been found. The populations found in this study may be the result of various factors such as the conditions of the mammary glands, the udder skin, the milking machine, air quality and milking practices as sources of contamination. Even if general health requirements have XVII been met, the microbiota of the local ecosystem will have a noticeable impact on the bacterial populations of raw milk. Whey samples were also inoculated in MRS selective medium to obtain bacterial populations such as lactobacilli, where 30 isolates were obtained and three of these isolates where identified by molecular methods as L. fermentum strain LS3. This bacterium showed to be able to grow in a pH range of 3-8, indicating the possibility of surviving along the gastrointestinal tract. In the case of their survival in the presence of bile salts, no growth was shown. In addition, L. fermentum strain LS3 was found to be resistant to all antibiotics: ciprofloxacin, sulfamethoxasol and trimetroprim, ampicillin, cephalothin, cefotaxime, dichloxacycline, penicillin, vancomycin, clindamycin, erythromycin, gentamicin and tetracycline showing an inhibition halo of 0-9 mm. This antibiotic resistance should be further evaluated, for the presence of resistance genes acquired in probiotic microorganisms represents a danger to human health, due to the transfer of these genes to other bacteria present in the gastrointestinal microbiota, making the pharmacological treatments less effective against pathogenic bacteria that acquire these resistance genes