Diseño y construcción de un prototipo de dispositivo para el monitoreo en línea de biomasa por densidad óptica (DO)

Abstract

RESUMEN: Los procesos biotecnológicos juegan un papel central en la economía mundial actual, desde alimentos hasta productos farmacéuticos cada vez existen más productos elaborados a partir del aprovechamiento de sistemas biológicos. El monitoreo y control de bioprocesos permite la mejora de rendimientos y la optimización de los recursos. Las condiciones del ambiente donde se cultivan los microorganismos tienen un efecto sensible en su crecimiento y en la producción de metabolitos de interés, por lo que es de suma importancia monitorear en tiempo real estas variables ambientales (Lam, H., & Kostov, Y. ,2009). Previo al control y optimización de bioprocesos que generalmente se lleva a cabo en biorreactores instrumentados es necesaria una fase de experimentación extensiva donde se prueban diferentes condiciones de producción con el objetivo de caracterizar y modelar el sistema biológico. Usualmente esta fase de experimentación inicial es laboriosa, costosa en tiempo y recursos debido a que se lleva a cabo en cultivos en matraz agitado cuya principal desventaja es la dificultad reside en el monitoreo y control de cualquier variable de interés dentro del matraz. Las cinéticas en matraz agitado constan de múltiples matraces preparados bajo las mismas condiciones donde se espera que la cinética de crecimiento microbiano se lleve a cabo simultáneamente y de manera homologa, si se requiere hacer alguna determinación lo usual es abrir uno de los matraces para tomar la muestra y hacer las mediciones necesarias, el resto del contenido del matraz se desecha debido a la perdida de esterilidad. La biomasa es una variable de suma importancia en los bioprocesos, su determinación nos permite observar y comprender la cinética de crecimiento así como la taza de producción, de consumo de nutrientes, y el cálculo de balance; todos estos datos pueden ser aprovechados para establecer condiciones que vuelvan más eficiente el proceso de producción. A nivel laboratorio e industrial se han utilizado diferentes métodos para la determinación de biomasa, los cuales se pueden clasificar en: métodos medibles off-line y on-line, directos e indirectos, invasivos y no invasivos. Las técnicas de medición óptica ofrecen muchas ventajas en el campo de las ciencias de la vida, estas ventajas incluyen técnicas de mediciones adaptables sin contacto, no destructivas y rápidas, además de que las piezas que lo componentes como las fuentes de luz y los 5 dispositivos de detección se han vuelto más baratos y más sofisticados en la última década, y el micro- mecanizado y la micro-estructuración ofrecen nuevos dispositivos interesantes (G. Gauglitz et al. G. Proll, 2007). Además los métodos ópticos son fácilmente multiplexados, es posible trabajar con muchas longitudes de onda simultáneamente sin que las señales interfieran entre sí. Otra ventaja de los métodos ópticos es la capacidad de emplear trayectoria libre o remota sin la necesidad de conexiones de alambre. La densidad óptica es un indicador estándar para el crecimiento celular, sin embargo el muestreo y la preparación de la muestra es inconveniente y requiere de mucho tiempo. Así mismo este proceso off-line pone en riesgo al cultivo celular de contaminarse, particularmente si se cultiva en matraces de agitación. Por lo tanto los sensores de densidad óptica en línea e in situ representan un interés específico. Las medidas directas en recipientes con agitación son difíciles porque los movimientos que da el sistema de agitación da como resultado un aumento y disminución periódicos de la altura del líquido y esto provoca que la señal tenga algunas impurezas (Lam, H., & Kostov, Y., 2009). Finalmente, los sensores ópticos son usualmente no lineales, es necesario realizar un conjunto de cálculos para encuentra el valor real del parámetro medido (Lam, H., & Kostov, Y. ,2009). Ciertamente existen también programas en los que se modela el crecimiento microbiano, los cuales realizan predicciones en base al tiempo de fermentación; sin embargo, para generar estos modelos matemáticos es necesaria una gran cantidad de información, que por lo general no está disponible en la fase inicial de experimentación a nivel matraz con un nuevo microorganismo. Generalmente, en las cinéticas de matraces se basan en la experiencia para realizar el pase cuando se escala a un biorreactor nivel laboratorio. Existen dos problemas mayores al intentar desarrollar sistemas de medición aplicables a cultivos en matraz agitado, el primero es la miniaturización de las sondas y el segundo es mantener la esterilidad al interior del matraz. Como menciona Lam, H., & Kostov, Y. (2009) el reactor instrumentado es un equipo diseñado para la colocación de sondas de medición, sellado perfecto y, frecuentemente, esterilización in situ; sin embargo, en un matraz que no cuenta con un sistema tan sofisticado de sellado o entradas para sensores específicos, el hecho de mantener la esterilidad es un problema. 6 Recientemente se desarrolló un nuevo conjunto de herramientas para el monitoreo de bioprocesos los cuales se basan en principios ópticos que permiten mediciones no invasivas a través del espacio y funcionan en equilibrio con el analito. Su estructura interna y principios de funcionamiento son muy diferentes de los sensores regulares, en primer lugar, utilizan un elemento óptico que reside dentro del recipiente de bioprocesamiento. Esto puede ser un parche de detección con química inmovilizada, o dispositivo de dirección del haz. Este elemento óptico tiene que ser tanto esterilizable como inerte cuyos materiales típicos son vidrio o polidimetilsiloxano (PDMS), aunque también es posible un número de otros materiales (es decir, polipropileno, Teflón, etc.). Las variaciones de luz observadas se convierten en señales eléctricas y se digitalizan. El presente trabajo pretende desarrollar un dispositivo capaz de monitorear en línea el crecimiento microbiano para la optimización de medios de cultivo, así como determinación del tiempo óptimo de pase a inoculación de reactor. Con el objetivo de no afectar las condiciones de esterilidad al interior del matraz y para economizar y facilitar la implementación de los sensores el dispositivo propuesto es del tipo no invasivo, lo que significa que todos los componentes necesarios para llevar a cabo la medición serán colocados fuera del matraz.