Estudios teóricos y experimentales de compuestos anticáncer acoplado a dendrímeros como nanoacarreadores

Abstract

RESUMEN: Recientes descubrimientos sobre la fisiopatología oncológica señalan a la sobre expresión de las histonas deacetilasas (HDACs) como una de las principales alteraciones epigenéticas y, específicamente en cáncer de mamá, la HDAC8 juega un rol importante en la resistencia a la terapia antineoplásica y migración celular. Tomando como antecedente que las neoplasias oncológicas de tejido mamario son dependientes de la estimulación estrogénica, se descubrió al receptor estrogénico acoplado a proteínas G (GPER), el cual es activado por estradiol (E2) incrementando la proliferación y favoreciendo la migración celular. Nuestro equipo de trabajo ha profundizado en la investigación sobre estos blancos farmacológicos (GPER e HDAC8). Por lo que seleccionamos un grupo de ligandos previamente evaluados, las cuales a través de estudios in silico mostraron una probable interacción con las moléculas previamente citadas, los ligandos en cuestión presentan escasa hidrosolubilidad, motivo por el cual no lograron ser evaluados óptimamente en modelos in vitro. Es por ello que este proyecto de investigación propone el uso de dendrímeros PAMAM G4 como moléculas acarreadoras con la finalidad de aumentar la hidrosolubilidad de dichos ligandos para su posterior evaluación en modelos in vitro. Se seleccionaron seis moléculas en total: G1 P, G1 AU, VPA CF, VPA MF, VPA NF y VPA FF, determinando las propiedades toxicobiológicas de cada uno de los ligandos, se determinó que los ligandos “VPA-NF y “G1-ACILUREA” demostraron tener riesgo alto y medio para ambas; mutagenicidad y teratogenicidad, respectivamente. Las seis moléculas fueron sometidas a un estudio de acoplamiento molecular sobre el dendrímero PAMAM G4, encontrando interacciones tipo puente de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas, con valores de energía libre de unión (G) oscilantes entre -4.47 y -15.49 Kcal/mol. A su vez se realizó la evaluación por acoplamiento molecular del dendrímero con moléculas de referencia (VPA, G1, G15) y fármacos antineoplásicos reportados en la literatura (doxorrubicina, 5-fluoruracilo y metotrexate). Posteriormente se efectuaron estudios de dinámica molecular los cuales mostraron estabilidad de los complejos compuesto – dendrímero, con una variación del radio de giro entre 0-5 – 2.0 Ångströms (Å). El ligando que presentó mejores interacciones con el dendrímero PAMAM G4 fue “G1-P”, dichas interacciones fueron más favorables con el dendrímero en su estado desprotonado. Mediante HPLC acoplado a UV vis se realizaron experimentos de hidrosolubilidad en tres ligandos (VPA MF, VPA CF, G1 P), encontrando aumento de la misma directamente proporcional a la cantidad de dendrímero utilizada, dichos experimentos fueron realizados a distintos valores de pH, observando variaciones en la cantidad de fármaco acarreada por el dendrímero. Se realizó resonancia magnética nuclear de 1H del complejo “G1P” – dendrímero, en la que se observa desaparición del grupo carbonilo presente en “G1P”, lo cual sugiere que la interacción de estas dos moléculas se realiza en el grupo funcional previamente citado; dicho resultado se correlaciona con los datos obtenidos por acoplamiento molecular. Finalmente, y con el objetivo de evaluar el complejo fármaco – dendrímero en cultivos celulares, se determinó el rango de concentración máxima no toxica del dendrímero PAMAM G4 en las líneas celulares: MDA-MB-231, MCF-7 y 3T3-L1. Obteniendo concentraciones máximas no tóxicas de: 300 nM, 400 nM y 300 nM, respectivamente. En la línea celular MDA-MB 231 el compuesto G1P produjo disminución de la proliferación celular en un 38% a una concentración de 2.4 M, el compuesto VPA CF produjo 20% de disminución de la proliferación celular a una concentración de 10 M, el compuesto VPA MF no produjo alteración de la proliferación celular. En la línea celular 3T3 – L1(el compuesto G1P produjo disminución de la proliferación celular en un 20% a una concentración de 2.4 M, el compuesto VPA CF produjo 10% de disminución de la proliferación celular a una concentración de 10 mM. Finalmente, el compuesto VPA MF no produjo alteración de la proliferación celular. En la línea celular SKBr 3 los complejos dendrímero – compuesto no mostraron alteración de la proliferación celular. Máxima cantidad de dendrímero utilizada 500 nM. ABSTRACT: Recent discoveries about cancer pathophysiology tell us that over-expression of histone deacetylases (HDACs) is one of the main epigenetic alterations and, specifically in breast cancer, HDAC8 plays an important role in resistance to anticancer therapy and cell migration. As antecedent oncological neoplasms of breast tissue are estrogenic stimulation dependent. G Protein-Coupled Estrogen Receptor (GPER), is activated by estradiol (E2) increasing the proliferation and promoting cell migration was found. Our work group has delved into research on these targets (GPER and HDAC8). We select a group of previously evaluated ligands, which, through in silico studies, showed probable interaction with the previously mentioned molecules, these ligands have poor water solubility, why failed to be evaluated optimally in in vitro models. That is why this project proposes the use of PAMAM G4 dendrimers as haulers molecules in order to increase the water solubility of the ligands mentioned above for further evaluation in in vitro models. Six molecules were selected: G1 P, G1 AU, VPA CF, VPA MF, VPA NF and VPA FF, determining toxicobiological properties of each ligands, it was determined that the ligands "VPA-NF and "G1 AU"showed have low and high-risk for both; mutagenicity and teratogenicity, respectively. The six molecules were subjected to a molecular docking study against PAMAM G4 dendrimer, finding hydrogen bond and hydrophobic interactions, with values of free binding energy (G) oscillating between -4.47 and -15.49 kcal / mol. Evaluation by molecular docking with reference molecules (VPA, G1, G15) and antineoplastic drugs reported in the literature (doxorubicin, fluorouracil and methotrexate) was made. A molecular dinamic study was made, shown that he compund - dendrimer complex were stable. with a variation of radius of giration between 0-5 - 2.0 angstroms (Å). The ligand that showed better interactions with PAMAM G4 dendrimer was "G1P", these interactions were more favorable with PAMAM G4 dendrimer in its deprotonated state. solubility experiments via HPLC coupled to UV vis were performed in three ligands (VPA MF, VPA CF, G1 P), finding hidrosolubility enhance directly proportional to the amount of dendrimer used, these experiments were performed at different pH values, observing variations in the amount of drug carried by the dendrimer. 1H nuclear magnetic resonance "G1P" - dendrimer complex was performed, wherein disappearance of the carbonyl group present in "G1P" was observed, suggesting that the interaction of these two molecules is made in the mentioned above functional group; This result correlates with the data obtained by molecular docking. Finally, in order to evaluate the compound - dendrimer complex in cell cultures, the PAMAM G4 dendrimer maximum non-toxic concentration was determined in the cell lines: MDA-MB-231, MCF-7, SKBr 3 and 3T3-L1. Obtaining nontoxic maximum concentrations: 300 nM, 400 nM, 500 nM and 300 nM, respectively. In MDA-MB 231 cell line the compound G1P produced cell proliferation decrease by 38% at a concentration of 2.4 M, VPA CF produced 20% cell proliferation decrease at a concentration of 10 M, the compound VPA MF did not produce alteration on cell proliferation. On SKBr 3 cell line, the compound - dendrimer complex did not show alteration ofncell proliferation. Dendrimer used maximum concentration: 500 nM. On 3T3 - L1 cell line, G1P produced cell proliferation decrease by 20% at a concentration of 2.4 M, VPACF produced 10% decrease of cell proliferation at a concentration of 10 M. Finally, VPA MF compound did not alter cell proliferation.