Desarrollo de un vector sintético pTracer/rAs3mt a partir de un vector retro viral pLEGFP-N1/rAs3mt

Abstract

RESUMEN: Antecedentes. El arsénico (As) es un elemento ubicuo, estudios epidemiológicos han demostrado una asociación por exposición a niveles elevados de arsénico y sus metabolitos en la incidencia de carcinomas en vejiga, piel y pulmón, enfermedades cardiovasculares y diabetes mellitus tipo 2, diversas investigaciones han propuesto que los productos del metabolismo de este elemento como son el monometilarsénico (MMA) y dimetilarsénico (DMA) están implicados en el desarrollo de estas enfermedades dado que se ha encontrado que son más reactivos y tóxicos que el propio As inorgánico, sin embargo el mecanismo aún no ha sido elucidado. (Lai et al., 1994, Thomas et al., 2007, Díaz et al., 2006, Fu et al., 2010) Modelos in vivo sin considerar MMA y DMA han demostrado en ratones expuestos a 0.01% de arsenito de sodio en agua potable una hiperproliferación de células epiteliales de vejiga dentro de las 4 semanas de iniciar el tratamiento y está relacionado con la activación de la vía MAP cinasa. (Luster et al., 2004) Estudios en células humanas demostraron que el AsIII puede afectar la progresión del ciclo celular en células escamosas epiteliales de vejiga, produciendo arresto celular en la fase S. (Hernández et al., 2005, 2008a) Estudios recientes asocian que el MMA y DMA en su forma trivalente causa daños en vías de señalización asociadas a cambios en la proliferación, ciclo celular y diferenciación celular en células escamosas de pulmón relacionado al desarrollo de carcinogénesis; por ello se ha empleado la toxicogenómica en el desarrollo de modelos in vitro que permitan estudiar esta asociación para otros tipos de cáncer. (Loffredo et al., 2003, Salazar et al., 2004; Hernández et al., 2008a; Moore et al., 2012; Hubaux et al., 2013; Preyaporn et al., 2013) En la actualidad se utilizan métodos alternativos que no utilizan animales en el estudio de la carcinogenicidad, estos modelos incluyen la tecnología recombinante empleando transformación celular basada en cambios fenotípicos y genotípicos con la finalidad de elucidar el mecanismo por el cual producen dicho efecto por detección de modificaciones traduccionales, detección de promotores y cuantificación analítica de ser posible. (Preeyaporn et al., 2013) Métodos. Por restricción enzimática se obtuvo la enzima arsénico 3 metil transferasa de rata (rAS3MT) encargada del proceso de biometilación del As; a partir del vector retroviral pLEGFPN1/rAs3mt usado en el desarrollo de la línea celular UROtsa/F35 que expresa la rAs3mt y se desarrolló el vector sintético de transfección pTracer/rAs3mt así como el vector transitorio pGEM-T Easy/rAs3mt, empleando transformación de bacterias competentes, ligación y restricción enzimática, secuenciando e identificando la enzima en cada vector. (Drobná et al., 2010) La aplicación del vector pTracer/rAs3mt es mejorar la eficiencia de transfección por medio de un modelo in vitro para generar un biosistema que permita estudiar y valorar los efectos tóxicos del As y sus metabolitos en líneas celulares humanas donde se ve implicado el desarrollo de una patología específica e identificar cambios en los procesos de respuesta celular, ciclo celular y la generación de especies reactivas de oxígeno. (Watanabe et al., 2013). Resultado. Se obtuvo un vector sintético de transfección pTracer/rAs3mt para células eucariontes y un vector transitorio pGEM-T Easy/rAs3mt para células procariontes con un inserto de rAs3mt identificado y secuenciado, que conserva dentro de su secuencia los sitios conservados de residuos de cisteína en el caso Cys-32, Cys-72, Cys-85, Cys-226, Cys-250, Cys-271, Cys-360, Cys-368 y Cys-369, los cuales confieren estabilidad estructural a la enzima además de preservar el centro catalítico de la enzima conformado por Cys 61, Cys 156 y Cys 206. Además se logró un proceso de transferencia de tecnología y automatización de un sistema de generación de hidruros por crio-atrapamiento usando espectrometría de absorción atómica que permite evaluar los metabolitos del arsénico MMA y DMA que se producen en medio celular que fijan un intervalo de concentración de trabajo a un nivel de ultramicroanálisis. Conclusión. La tecnología recombinante permite el diseño de vectores sintéticos como pTracer/rAs3mt y pGEMT-Easy útiles para el desarrollo de estudios toxicogenéticos para generar información significativa en un modelo celular que permitan elucidar mecanismos de acción o extraer datos que con un método convencional de prueba no se podrían obtener. ABSTRACT: Background Arsenic (As) is a ubiquitous element, epidemiological studies have shown an association of exposure to high levels of arsenic and its metabolites in the incidence of bladder, skin and lung cancer, cardiovascular disease and diabetes mellitus type 2, several studies have proposed that products metabolism as this element monomethylarsonic acid (MMA) and dimethylarsinic acid (DMA) are involved in the development of these diseases since it has been found to be more reactive and toxic than inorganic arsenic itself, however the mechanism has not yet been elucidated. (Lai et al., 1994, Thomas et al., 2007, Díaz et al., 2006, Fu et al., 2010) In vivo models regardless MMA and DMA have shown in mice exposed to 0.01 % of sodium arsenite in water hyperproliferation of bladder epithelial cells within 4 weeks of starting treatment and is associated with activation of the MAP kinase pathway.(Luster et al., 2004) Studies on human cells showed that AsIII can affect cell cycle progression in bladder epithelial squamous cell producing cell arrest in S phase. (Hernández et al., 2005, 2008a) Recent studies associate that the MMA and DMA in its trivalent form are associated to causes damage signaling pathways, changes in proliferation, cell cycle and cell differentiation in squamous cell lung carcinogenesis development related; therefore toxicogenomics was used in the development of in vitro models to study the association to other cancers. (Loffredo et al., 2003, Salazar et al., 2004; Hernández et al., 2008a; Moore et al., 2012; Hubaux et al., 2013; Preyaporn et al., 2013) Currently alternative methods not used in the study animals for the carcinogenicity are used; these models using recombinant technology include cellular transformation based on phenotypic and genotypic changes in order to elucidate the mechanism by which this effect produced by modification detection translational, detection and analytical quantification promoters if possible.(Preeyaporn et al., 2013) Methods By enzymatic restriction we obtained the enzyme arsenic 3 methyl transferase from rat (rAS3MT) charge of the process of arsenic biomethylation; from retroviral vector pLEGFP -N1 / rAs3mt used in development of the cell line UROtsa / F35 it expressing rAs3mt and development a synthetic transfection vector pTracer / rAs3mt and a transient vector pGEM-TEasy / rAs3mt , using transformation in competent bacteria, enzymatic ligation and restriction, sequencing and identifying the enzyme in each vector. (Drobná et al., 2010) The application of the vector pTracer/rAs3mt is to improve the efficiency of transfection by an in vitro model to generate a biosystem to enable study and evaluate the toxic effects of arsenic and its metabolites in human cell lines which is involved the development of a specific pathology and identify processes changes in cellular response, cell cycle and the generation of reactive oxygen species. (Watanabe et al., 2013). Results A synthetic transfection vector was obtained pTracer/rAs3mt for eukaryotic cells and a transient vector was obtained pGEM-T Easy/rAs3mt with an insert of rAs3mt identified and sequenced , retaining within its sequence sites conserved cysteine residues was obtained in this case Cys-32, Cys-72, Cys-85, Cys-226, Cys-250, Cys-271, Cys-360, Cys-368 and Cys-369 which confer structural stability to the enzyme in addition to preserving the enzyme catalytic center composed of Cys 61, Cys 156 y Cys 206. In addition a process of transfer of technology and automation of a hydride generation system by cryo- trapping using atomic absorption spectrometry that allows to evaluate metabolites of arsenic MMA and DMA that are produced in cell media setting a working concentration range to a level ultramicroanalysis . Conclusions Recombinant technology allows the design of synthetic vectors as pTracer / rAs3mt and pGEMT -Easy useful for developing significant toxicogenetics studies to generate information on a cell model that allow elucidate mechanisms of action or extract data as a conventional test method is not they could get