Evaluación de nanopartículas de oro, recubiertas con capas poliméricas, como vehículos para transferencia de genes

Abstract

RESUMEN: Las nanopartículas de oro han sido ampliamente investigadas en distintos campos. Una de sus aplicaciones como vehículos de transferencia en terapia génica es ampliamente investigada, debido a las propiedades físicas particulares de este tipo de materiales, como densidad, dispersión y la posibilidad de generarse en tamaños menores a diez nanómetros. Las enfermedades posibles de tratar con la terapia génica incluyen desde las monogénicas hereditarias hasta las poligénicas e infecciosas, siendo el vehículo de entrada, un factor importante en el desarrollo de la terapia. No obstante, para reducir la degradación de los ácidos nucleicos, se ha estudiado la adhesión de polímeros catiónicos en la superficie de las nanopartículas. Se probaron nanopartículas de oro sintetizadas por distintos métodos, aquellas obtenidas a partir de reducción por citrato de sodio no fueron viables para la adhesión de DNA, por su carga superficial positiva. Las obtenidas por borohidruro de sodio como agente reductor requirieron un agente estabilizador, por lo que se modificaron con quitosano, el cual ha demostrado ser un adecuado agente estabilizador. Un tercer método consistió en la síntesis de nanopartículas de oro, aprovechando las propiedades del quitosano cómo agente reductor y estabilizador. A partir de estos últimos dos métodos, el presente trabajo reporta experimentalmente el uso de nanopartículas de oro, acopladas con quitosano, quitosano acilado y quitosano oligosacárido, evaluando la eficiencia de transfección de DNA plasmídico al cultivo celular HEK-293. Se evaluaron las propiedades físicas y químicas de los compositos de nanopartículas de oro y quitosano, mediante potencial , espectroscopía UV-Visible y TEM, reportando un método alternativo para la caracterización de los nanomateriales sintetizados por medio de espectroscopía fotoacústica. Se demostró por medio de electroforesis, la estabilidad de los complejos formados con nanopartículas de oro, quitosano y DNA plasmídico, y su fuerza de adhesión. Se determinó la viabilidad celular de las células transfectadas por actividad de la β- galactosidasa, producto de la expresión genética del DNA plasmídico pSV-β-galactosidasa, por medio de la técnica histoquímica que utiliza como sustrato al X-gal, con lo que las células transfretados se tiñeron de color azul, y se observó también con la fluorescencia del DNA plasmídico pIRES-2-EGFP. Se observó transfección la línea celular HEK-293, obteniendo porcentajes de transfección con los complejos de quitosano modificado, mayores al control positivo (Lipofectamina, 38%). El porcentaje de transfección obtenido con quitosano fue de 27%, 33% con quitosano acilado y 60% con quitosano oligosacárido. Se demostró que el tamaño de nanopartículas de oro con quitosano modificado, su relación entre cargas y su morfología, son factores que influyen en la eficiencia de transfección celular de DNA plasmídico, obteniendo el mayor porcentaje de transfección con el quitosano oligosacárido. Adicionalmente se realizaron bioensayos de toxicidad en Daphnia pulex y Lemna valdiviana, con las nanopartículas sintetizadas con citrato de sodio y aquellas con borohidruro de sodio recubiertas con quitosano. ABSTRACT: Gold nanoparticles have been widely researched in different fields. Their application as transfer vehicles in gene therapy is of especial interest due to the particular physical properties of this type of material, such as density, dispersion and the possibility of being synthesized in sizes smaller tan ten nanometers. The possible diseases to treat with the gene therapy include that ones from monogenetic hereditary to polygenetic and infectious ones. being the intake vehicle, an important factor in the development of the therapy. However, to reduce the degradation of nucleic acids, the adhesion of cationic polymers on the surface of nanoparticles has been studied. Gold nanoparticles synthesized by different methods were tested, those obtained from reduction by sodium citrate were not viable for DNA adhesion, due to their positive surface charge. Those obtained by sodium borohydride as a reducing agent required a stabilizing agent, so they were modified with chitosan, which has proved to be an adequate stabilizing agent. A third method consisted of the synthesis of gold nanoparticles, taking advantage of the properties of chitosan as a reducing and stabilizing agent. From these last two methods, the present work experimentally reports the use of gold nanoparticles, coupled with chitosan, acylated chitosan and oligosaccharide chitosan, evaluating the transfection efficiency of plasmid DNA to the HEK-293 cell culture. The physical and chemical properties of gold and chitosan nanoparticle composites were evaluated, using Z potential, UV-Vis spectroscopy and TEM, reporting an alternative method for the characterization of the synthesized nanomaterials by means of photoacoustic spectroscopy. The stability of the complexes synthesized with gold nanoparticles, chitosan and plasmid DNA and their adhesion strength was demonstrated by means of electrophoresis. The cell viability of the transfected cells was determined by β- galactosidase activity, product of the plasmid DNA gene expression pSV-β-galactosidase, by means of the histochemical technique that uses X-gal as a substrate, thus transfected cells stained blue, and was also observed with the plasmid DNA fluorescence pIRES-2-EGFP. The HEK-293 cell line was transfected, obtaining percentages of transfection with the modified chitosan complexes, greater than the positive control (Lipofectamine, 38%). The percentage of transfection obtained with chitosan was 27%, 33% with acylated chitosan and 60% with chitosan oligosaccharide. It was demonstrated that the size of gold nanoparticles with modified chitosan, their relation between charges and their morphology, are factors that influence the efficiency of cellular transfection of plasmid DNA, obtaining the highest percentage of transfection with chitosan oligosaccharide. In addition, toxicity bioassays were performed on Daphnia pulex and Lemna valdiviana, with the nanoparticles synthesized with sodium citrate and those with sodium borohydride coated with chitosan.